液相色谱仪的基本概念和术语（二）

三、柱效参数

⑴理论塔板数（theoretical plate number,N）用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
    N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：
N=（tR/σ）2=16（tR）2/W =5.54（tR/W1/2）2
W：峰宽 ； σ：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。
N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。
    用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用调整保留时间（tR’）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）=16（tR’/W）2

⑵理论塔板高度（theortical plate height,H）每单位柱长的方差。H=。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H=L/N

四、相平衡参数（distribution coefficient,K）
    在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K=[xs]/[xm]
Cs-溶质在固定相中的浓度 Cm－溶剂在流动相中的浓度
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为滲透参数。但一般情况可用分配系数来表示。
    在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs 、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减少，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度的增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能较少进样量，使组份在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
    在同一色谱条件下，样品中K值大的组份在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组份则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组份的分配系数相差越大，越容易分离，因此，混合物中各组份的分配系数不同是色谱分离的前提。
    在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及PH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

1、容量因子（capacity factor,K）--化合物在两相间达到平衡时，在固定相与流动相中的量之比。K＝（tR-t0）/t0=tR’/t0（或溶质在固定相中的量/溶质在流动相中的量）。因此，容量因子也称质量分配系数。
｛K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=（tR-t0）/t0=K*Vs/Vm Vs：色谱柱中固定相的体积； Vm：色谱柱中流动相的体积。｝
分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k===K=,tR’=kt0。上式说明容量因子的物理意义：表示一个组份在固定相中停留的时间（tR’）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k=0时，化合物全部存在与流动相中，在固定相中不保留，tR’=0;k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。
容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于tR’、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。

2、选择性因子（selectivity factor,α）--相邻两组份的分配系数或容量因子之比。α＝＝（设k2>k1）。因k=tR’/t0,则α＝k2/k1，所以α又称为相对保留时间（《美国药典》）。
要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

五、分离参数

1、分离度（resolution,R）--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R=（tR2-tR1）/[（W1+W2）/2],当W1=W2时，R=。当R=1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露锋面积为95.4％，内测峰基重叠约2％。R=1.5时，称为6σ分离，裸露锋面积为99.7％。R≥1.5称为*分离。《中国药典》规定R应大于1.5。

2、基本分离方程――分离度与三个色谱基本参数有如下关系：
R=1/4（а-1）×N0.5×［k’/（1+k’）］
其中N称为柱效项，α为柱选择项，k’为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两项与色谱过程热力学因素有关。
从基本分离方常可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R=0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及PH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的zui容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2 不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2 在1～10范围内，为2～5，窄径柱可更小些。

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