鸡组织中甲基盐霉素残留量的测定实验

一、实验部分
1、仪器与试剂
    液相色谱仪，配柱后衍生装置和二极管阵列检测器；inertsil ODS3C18液相色谱柱（25 cm×46mm，5μm）；离心机（Sigma公司）；UltraTyrrax T25型匀质器（德国）；硅胶S小柱（500 mg，3mL）。甲基盐霉素标准品（Sigma 公司）。香草醛（Fluka公司）；衍生液配制：量取5 mL H2SO4，缓慢加入到250mL甲醇中，置冰水浴中缓慢加入20 g香草醛，混匀，脱气5min后避光保存，临用现配；异辛烷和甲醇均为色谱纯（Fisher公司）；乙酸和浓H2SO4为分析纯（北京化学试剂公司）。

2、色谱分离条件
   流动相：V（甲醇）∶V（乙酸）∶V（水）=94∶3∶3；流速： 08 mL/min；衍生液流速：04mL/min；反应温度： 95 ℃；检测波长： 520 nm；进样量： 100 μL；柱温： 30 ℃。

3、样品处理
1）样品中甲基盐霉素的提取
   称取组织样品（50±005）g于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL蒸馏水，以10000r/min以上的速度均质60 s，再加入10 mL异辛烷，旋涡混合3 min左右，以3000 r/min离心5min，吸取上层有机相,备用。然后加入10 mL异辛烷，按上述步骤重复提取一次，取上层有机相,备用，合并两次离心后的有机相。
2）固相萃取净化
   用5 mL异辛烷预洗硅胶小柱，不使流干，加入231所得的上清液，然后再用5 mL异辛烷淋洗，过柱流速控制在1~2mL/min，然后抽干小柱，再用2 mL甲醇洗脱，于40℃水浴中氮气吹干后用10 mLV（甲醇）∶V（水）=90∶10混合液溶解，液相色谱仪测定。

4、线性实验
   称取100 mg甲基盐霉素于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得100mg/L甲基盐霉素标准储备液。吸取标准储备液10 mL于100 mL棕色容量瓶中，得10mg/L标准工作液。将标准工作液用流动相稀释成70、250、500、1000和5000 μg/L的标准工作溶液和10mg/L标准工作溶液一起进行HPLC分析。每个浓度进样6次，以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

5、添加回收率实验
   添加回收率实验添加浓度为20、100、300和600 μg/kg（鸡肉），20、100、600和1800μg/kg（鸡肝），20、100、300和600 μg/kg（鸡肾）及20、100、600和1200μg/kg（鸡脂肪）。称样后加入标准溶液，涡旋混匀放置05 h后进行样品处理，其它步骤同23。

二、结果与讨论
1、色谱条件的建立
   本实验色谱条件基本参照文献[4]进行分析，其中4种组织的添加浓度均为20μg/kg，所得图谱见图1。从图1可知，甲基盐霉素出峰时间为656 min，峰形较好，在空白组织中未见干扰。

2、提取和净化条件的选择
   甲醇、乙睛、丙酮、异辛烷和正已烷可用于提取聚醚类药物，但为减少后续净化的压力，通常选择极性相对较低的异辛烷、氯仿、乙酸乙酯等。本实验对异辛烷的提取条件进行了优化，发现当鸡肉中添加浓度为5000μg/kg时，提取两次（每次10mL）直接进样扣除空白后的回收率>95%。通常，选择正相固相萃取净化动物组织中的聚醚类药物，有氧化铝小柱和硅胶小柱。本实验在参考文献[4]的净化方法和不影响方法灵敏度的基础上，将10mL二氯甲烷洗涤液改为5 mL异辛烷，6 mL二氯甲烷/甲醇洗脱液改为2 mL甲醇，节约了溶剂，缩短了实验时间。

3、衍生化条件的优化
   固定流动相流速，以4种鸡组织样品为基质，考察衍生液的流速对信噪的影响。实验发现，当衍生液流速为01~04mL/min时，各种组织的添加样品（浓度100 μg/kg）的信噪比逐步增加；流速为04~08mL/min时，信噪比均无明显变化。实验选择衍生液的流速为04 mL/min。

4、线性实验
   根据线性实验方法，在07~100mg/L范围内，以峰面积对甲基盐霉素浓度作图，所得标准曲线方程为y=1058x+105，相关系数均大于09993，说明本方法适用于甲基盐霉素的定量分析。

5、方法的检出限、回收率和精密度
   采用在空白样品中添加标准溶液的方法，对4种鸡组织进行了4次添加回收率重复实验，每次每个浓度点进行5次重复实验，实验结果见表1。从表1可见，鸡组织中各浓度点平均添加回收率在764%~931%之间。批内相对标准偏差（RSD）在26%~89%之间，批间相对标准偏差（RSD）在47%~97%之间，可见本方法具有较好的准确性和稳定性。甲基盐霉素在4种鸡组织中的检出限均为60μg/kg （S/N=3），定量限均为200 μg/kg （S/N=10）。表1 鸡组织中甲基盐霉素的平均回收率和相对标准偏差（略）

6、方法应用
   利用本方法对甲基盐霉素预混剂在鸡体内休药期进行了检测。休药0 h,鸡肉中含甲基盐霉素（852±26）μg/kg（n=3）;休药48 h后,鸡肉中未检出甲基盐霉素。


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