HPLC法测定清颗粒中黄芩苷的含量实验

一、实验目的及背景
    建立液相色谱法测定一清颗粒中黄芩苷的含量。
方法：采用Hypersill C18（250×4.6mm，5μm）色谱柱，以甲醇－0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pH值至2.7）（42：58）为流动相；流速为1.000mL/ moL，检测波长275nm，柱温29℃。
结果：黄芩苷在0.0916～0.7608μg范围内成良好的线性。（r=0.9945），平均回收率98.9%，RSD=0.31%。
结论：方法简便、快速、适用性好，可用于该制剂的质量控制。
    一清颗粒是中药复方制剂，黄褐色；味微甜、苦。由黄连 ，大黄 ，黄芩共 3味中药组成，具清热泻火解毒，化瘀凉血止血。用于火毒血热所致的身热烦躁，目赤口疮，咽喉、牙龈肿痛，大便秘结，吐血，咯血，衄血，痔血等症；咽炎，扁桃体炎。为了更有效的控制制剂质量，采用液相色谱法对该制剂中黄芩苷进行了含量测定，为该制剂的生产提供了质量控制依据。

二、仪器与试药
    液相色谱仪，Breeze工作站。甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂为分析纯。黄芩苷对照（中国药品生物制品检定所，批号为110715-200212），一清颗粒。  

三、方法与结果
1、色谱条件与适用性试验
   色谱柱：Hypersil  C18（250×4.6mm，5μm），检测波长为275nm。流动相：甲醇－0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pH值至2.7）（42：58），理论塔板数按黄芩苷计算，应不低于5000。
2、对照品溶液制备
   精密称取在105℃干燥至恒重的黄芩苷对照品12.5mg，置250ml量瓶中，用少量甲醇溶解，用重蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含黄芩苷50μg），即得。
3、供试品溶液的制备
   取本品装量差异项下的内容物，混匀，研细，取约0.75g，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇10ml，超声处理10分钟，用重蒸馏水稀释至刻度，取此液离心10分钟，分取上清液，即得。
4、阴性样品溶液的制备
   取缺黄芩的模拟制剂约10g按供试品溶液的制备方法依法测定，结果表明：阴性样品的HPLC图谱中，无呈现与黄芩苷对照品保留时间相同的色谱峰。
5、测定法
   分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定含量，以峰面积积分按外标法计算。

四、线性关系考察
    精密吸取对照品溶液（浓度为：0.050mg/ml）2、4、6、8、10、12，依次进样，以进样量（μg）对峰面积进行线性分析，方程为Y=100135.548X-117.256，r=0.9945，结果表明黄芩苷在0.1000-0.6000mg间成良好的线性关系。
  
五、精密度试验
    精密吸取上述对照品溶液，连续进样6次，每次10μl，测定峰面积积分值，结果RSD为0.96%。
　
六、稳定性试验
    精密吸取上述对照品溶液，在0、2、4、6、8小时进样，共5次，每次10μl，测定峰面积积分值，结果RSD为0.80%，表明黄芩苷在8小时内稳定。
  
七、重复性试验
    取同一批号样品，按供试品溶液制备方法制备用6个测定结果进行评价（n=6），按正文含量测定项下色谱条件测定，结果RSD为 1.21%。
  
八、回收率试验
    取已测之含量的样品，平行6份，分别精密加黄芩苷对照品适量，按供试品制备方法制备和测定，计算6次的回收率，结果见表2；表2  回收率测定结果（略）

九、讨论
1、含量测定中选择色谱条件时，曾对流动相包括溶剂系统组成和比例进行了研究，，根据参考文献对多种溶剂的选择：（1）甲醇-水-磷酸（43：57：0.2）；（2）乙腈-水-冰醋酸（50：50：1）；（3）甲醇-水-冰醋酸（50：50：1）；甲醇－0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pH值至2.7）（42：58），根据分离情况，选择甲醇－0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pH值至2.7）（42：58），流速1ml/min。
2、曾对样品的提取方法进行考察，分别采用甲醇回流提取1h，甲醇提取0.5小时、50%甲醇、10%甲醇超声提取3种提取方法，经测定10%超声提取的效果好。
3、对提取工艺研究，以上三味，分别加水煎煮二次，*次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度约为1.25（70℃），喷雾干燥成干浸膏粉；将上述三种浸膏粉加入适量蔗糖与糊精，混匀，制成颗粒，干燥即得，此方法提取效果优于以往三药混合煎煮，而且含量高。

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