液相色谱法测定健骨胶囊中淫羊藿苷的含量实验

一、摘要
1、目的：建立用液相色谱法测定健骨胶囊中淫羊藿苷含量的方法。
2、方法：LichrospherC18 色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相甲醇-1.5%冰乙酸水溶液（55：45）；检测波长：270nm；流速1.0ml/min；柱温30℃。
3、结果：该方法淫羊藿苷回收率为99.28% RSD2.52%。结论：该方法简便、快速、灵敏度高，可用于该产品的质量控制。 
      健骨胶囊由淫羊藿、补骨脂等药材组成。用于肝肾不足所致骨质疏松症。淫羊藿为本方君药，主要含黄酮、木脂素、生物碱和多糖，淫羊藿苷是淫羊藿中的主要有效物质之一。故选择淫羊藿苷为指标测定淫羊藿的含量。由于方中药味较多，其他方法难于测定其含量，故本文采用液相色谱法测定健骨胶囊中淫羊藿苷的含量，该含量测定方法是在文献基础上结合本制剂的特点进行方法学考察而确立的。
  
二、仪器与试药
    戴安液相色谱仪，UVD340U二极管阵列检测器，ASI-100自动进样器，戴安色谱工作站，色谱柱：LichrospherC18 柱（5μm，150mm×4.6mm）；甲醇为色谱纯，水为重蒸水。淫羊藿苷对照品（批号111640-200401）由中国药品生物制品检定所提供。健骨胶囊，淫羊藿阴性胶囊由哈尔滨商业大学制剂室自制。
  
三、方法与结果

1、色谱条件
   色谱柱：LichrospherC18 柱（5μm，150mm×4.6mm）；流动相：甲醇-1.5%冰乙酸水溶液（55：45）；检测波长：270nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。分离度（R）：大于1.5；色谱柱的理论塔板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2500。
2、对照品溶液的制备
   精密称取经干燥至恒重的淫羊藿苷对照品，加甲醇溶解制成1.31mg/ml的对照品溶液。精密吸取对照品溶液5μl，注入液相色谱仪。
3、供试品溶液的制备
   取干燥至恒重的健骨胶囊内容物1g，研细，置于具塞锥形瓶中，精密称定，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过。取续滤液，即得。精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪。   
4、阴性供试液的考察
   取淫羊藿阴性胶囊内容物1g，研细，置于具塞锥形瓶中，精密称定，按2.3供试品溶液的制备项下方法操作。阴性样品在与对照品和供试品相对应的位置上无吸收峰。结果表明阴性供试液对样品溶液的测试无干扰。该法的专属性良好。
5、检测波长的选择
   取淫羊藿苷对照品溶液（3.64μg/ml），在230～500nm处进行扫描，结果在269.8nm波长处有zui大吸收，选定270nm做测定波长。
6、线性范围
   精密称取淫羊藿苷对照品13.1mg，置10ml容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。制成1.31mg/ml淫羊藿苷甲醇溶液。精密量取以上对照品溶液：0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml分别置于2ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，质量浓度分别为0.262、0.524、0.786、1.048、1.310mg/ml的对照品溶液。各精密量取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。以峰面积值（A）对浓度（C）进行线性回归，得回归方程，A=168.523C-2.982 r=0.9996，并以峰面积值A对浓度C作图，得一直线。以上结果表明，在0.262mg/ml～1.310mg/ml范围内，进样浓度与峰面积值有良好的线性关系。
7、精密度实验
   精密量取淫羊藿苷对照品溶液（1.31mg/ml）20μl注入液相色谱仪，重复进样6次，记录色谱图，计算相对标准偏差，试验表明：该法的精密度良好。
8、稳定性实验
   精密吸取同一供试品（批号050407）溶液，分别于0、2、4、6、8、12小时进样，依法测定，结果表明，供试品溶液在12小时内稳定。
9、 重现性实验
    按3供试品溶液的制备方法，对同一批样品（批号050407）6份进行测定，求得相对标准偏差RSD=0.50%。　
10、加样回收率实验
    分别取六份健骨胶囊内容物各0.5g，研细，置于具塞锥形瓶中，精密称定，分别加入一定浓度的淫羊藿苷对照品溶液，水浴蒸干，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。各精密量取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，该法的准确度较好。
11、检测限和定量限的测定
    为保证含量测定的准确，须确定供试品中被测物能被检测出的zui低量和被定量测定的zui低量。采用信躁比法，当淫羊藿苷浓度为26.2μg/ml时，信躁比为3∶1，则淫羊藿苷的检测限为26.2μg/ml；当淫羊藿苷浓度为39.3μg/ml时，信躁比为10∶1，则淫羊藿苷的定量限为39.3μg/ml。
12、耐用性试验
    考察流动相比例、流速的变动，对分离度等结果的影响。
    结论：在测定条件下，系统的轻微变动对试验结果影响不大，系统耐用性良好。
13、含量测定
    取健骨胶囊内容物1g，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，并转移至10ml量瓶中，即得。另取淫羊藿苷对照品，用甲醇制成每1ml中含淫羊藿苷1.31mg的溶液，作为对照品溶液。取供试品溶液与对照品溶液各5μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，测定结果表明10批次的制剂质量稳定。

四、讨论
    分别选用不同提取溶剂甲醇、氯仿、乙酸乙酯对健骨胶囊进行提取，测定。结果差别明显，氯仿、乙酸乙酯的提取量较低，用甲醇提取比较*。通过对供试液制备中提取时间的考察，结果显示提取时间为60、80分钟时，淫羊藿含量zui高，且无明显差异，提取40分钟淫羊藿苷含量较低，提取不充分，zui终确定提取时间为60分钟。
    该方法简便、快速、灵敏度高，可用于该产品的质量控制。

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